ABSTRACT
RESUMEN El manejo de las infecciones virales respiratorias, tanto a nivel nacional como a nivel mundial, requiere resultados científicos de calidad. La reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rRT-PCR, por su sigla en inglés) es considerada el "patrón de oro" para detectar el genoma del nuevo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), agente causal de la enfermedad por el nuevo coronavirus (COVID-19) sobre todo en la fase aguda de la infección. Su uso es controvertido fuera de un contexto de exposición viral. El objetivo del presente trabajo es analizar escollos encontrados durante la detección del genoma del SARS-CoV-2 que pueden producir resultados falsos. Los falsos negativos de rRT-PCR pueden deberse al momento y la eficacia de la toma de la muestra, la congelación, el almacenamiento y la descongelación, y a la inactivación térmica de la virulencia. Además, las señales retardadas de los controles internos invalidan la negatividad. Por otra parte, las muestras con escaso material biológico llevan a conclusiones negativas falsas, por lo que determinar un umbral (número mínimo de células epiteliales) contribuirá a reducirlas. Sin embargo, la mayoría de los kits detectan ADN humano, pero no fueron calibrados para cuantificar carga celular. Los ácidos ribonucleicos nucleares (ARN) virales adheridos a guantes, tubos y gorros, -entre otros elementos-, son fuente de falsos positivos. Las farmacopeas sugieren que la contaminación externa se controle en series de 100 muestras con al menos una representatividad del 10%. Si se extrapola esta aproximación al laboratorio de análisis clínicos, en lugar de uno se deberían procesar al menos 10 controles negativos contiguos a 10 positivos cada 100 pruebas. Mejorar la detección por rRT-PCR implica un aumento de al menos 20% en el costo de los reactivos, por lo que se necesitan recursos adicionales.
ABSTRACT Emerging respiratory viral infections like the severe coronavirus disease (CoVID 19) caused by novel coronavirus 2 (SARS-CoV-2) require quality results for science-based responses. The reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is considered the gold standard for detecting SARS-CoV-2 (particularly in the acute phase of infection). The aim of the present work was to analyze pitfalls during the search of viral genomes. False negative conclusions are result of sampling timing, performances of swabbing, storage, and thawing and heat-infectivity inactivation. Samples with low biologic material also lead to false negatives. Qualitative controls to detect the presence of human DNA are available in several kits but they were not calibrated for quantification of human cell loads. Moreover, negativity cannot be reported for samples with delayed signals for the internal control (due to deficiency in extraction and/or retro transcription and/or or to the presence of rRT-PCR inhibitors). The viral RNA that may have stick on gloves, on tubes, caps, etc. may produce false positives. The International Pharmacopoeias recommend for external contamination to test at least 10% of the samples. Couples of 10 negative contiguous to 10 positive controls randomly distributed should be therefore included in each series of 100 rRT-PCR tests. These improvements increase the cost of each determination (at least by 20% only for the reactants) and require additional resources.
ABSTRACT
El manejo de las infecciones virales respiratorias, tanto a nivel nacional como a nivel mundial, requiere resultados científicos de calidad. La reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (rRT-PCR, por su sigla en inglés) es considerada el "patrón de oro" para detectar el genoma del nuevo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), agente causal de la enfermedad por el nuevo coronavirus (COVID-19) sobre todo en la fase aguda de la infección. Su uso es controvertido fuera de un contexto de exposición viral. El objetivo del presente trabajo es analizar escollos encontrados durante la detección del genoma del SARS-CoV-2 que pueden producir resultados falsos. Los falsos negativos de rRT-PCR pueden deberse al momento y la eficacia de la toma de la muestra, la congelación, el almacenamiento y la descongelación, y a la inactivación térmica de la virulencia. Además, las señales retardadas de los controles internos invalidan la negatividad. Por otra parte, las muestras con escaso material biológico llevan a conclusiones negativas falsas, por lo que determinar un umbral (número mínimo de células epiteliales) contribuirá a reducirlas. Sin embargo, la mayoría de los kits detectan ADN humano, pero no fueron calibrados para cuantificar carga celular. Los ácidos ribonucleicos nucleares (ARN) virales adheridos a guantes, tubos y gorros, -entre otros elementos-, son fuente de falsos positivos. Las farmacopeas sugieren que la contaminación externa se controle en series de 100 muestras con al menos una representatividad del 10%. Si se extrapola esta aproximación al laboratorio de análisis clínicos, en lugar de uno se deberían procesar al menos 10 controles negativos contiguos a 10 positivos cada 100 pruebas. Mejorar la detección por rRT-PCR implica un aumento de al menos 20% en el costo de los reactivos, por lo que se necesitan recursos adicionales.
Subject(s)
Coronavirus Infections , Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction , False Negative Reactions , False Positive ReactionsABSTRACT
OBJECTIVES: Chlamydia trachomatis infections, in the context of extreme poverty, may trigger trachoma. Because the levels of C. trachomatis eye infections in Mexico are unknown, this study sought to determine if C. trachomatis was present in the conjunctiva of children living in three poor, rural areas of the country. METHODS: Clinical diagnosis of conjunctival follicles in children was conducted during the 2004 visual acuity assessment campaigns in rural areas of the states of Chiapas, Oaxaca, and Zacatecas. C. trachomatis detection was carried out by sampling the children with follicles and examining the specimens after Giemsa or microimmunofluorescence (MIF) staining. RESULTS: A total of 941 children from 6 to 12 years of age were examined in 2004. Of the 484 in Chiapas, 30 percent were found to have follicles; of the 181 in Zacatecas, 22 percent; and of the 276 in Oaxaca, 42 percent. C. trachomatis was detected at levels ranging between 2 percent and 5 percent; positive by Giemsa in 4.5 percent of the children with follicles, and by MIF in 15.5 percent. CONCLUSIONS: Considering that the chlamydiae sampling procedures and detection methods used in this study were not the most sensitive, the results underestimate the chlamydial eye infections and represent a conservative assessment of a potential risk for preventable visual impairment. Because C. trachomatis was detected here at levels similar to those reported for low-endemic trachoma areas, health authorities should be prepared to implement appropriate measures should it be confirmed that the visual health of MexicoÆs children is at risk.
OBJETIVOS: En un contexto de pobreza extrema, la infección por Chlamydia trachomatis puede desencadenar el tracoma. Debido a que se desconocen los niveles de infección ocular con C. trachomatis en México, el objetivo de este estudio fue determinar la presencia de C. trachomatis en la conjuntiva de niños de tres zonas rurales pobres de México. MÉTODOS:El diagnóstico clínico de folículos conjuntivales en los niños se llevó a cabo durante la campaña de evaluación de la agudeza visual en áreas rurales de los estados de Chiapas, Oaxaca y Zacatecas en 2004. Para la detección de C. trachomatis se tomaron muestras de los niños con folículos y se analizaron mediante la tinción de Giemsa o microinmunofluorescencia (MIF). RESULTADOS: En total se examinaron 941 niños de 6 a 12 años de edad en 2004. Se observaron folículos en 30 por ciento de los 484 niños de Chiapas, en 22 por ciento de los 181 de Zacatecas y en 42 por ciento de los 276 niños de Oaxaca. Se detectó C. trachomatis en niveles entre 2 por ciento y 5 por ciento; de los niños con folículos, 4,5 por ciento resultaron positivos por Giemsa y 15,5 por ciento por MIF. CONCLUSIONES: Estos resultados subestiman el nivel de infección ocular por clamidia, ya que los procedimientos de muestreo y los métodos de detección de clamidia empleados en este estudio no eran los más sensibles, por lo que representan una valoración conservadora del riesgo de trastornos visuales prevenibles. Como los niveles de C. trachomatis encontrados son similares a los informados para áreas de baja endemia de tracoma, las autoridades de salud deben estar listas para implementar medidas apropiadas si se confirmaran los riesgos para la salud visual de los niños mexicanos.